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de onda que se deseja. O aparelho então mede a absorbância em cada comprimento de onda dentro da faixa escolhida, gerando um gráfico, conhecido como espectro de absorção. É possível preparar diferentes concentrações de um mesmo material que se deseja analisar e medir a absorbância de cada uma dessas soluções. Dessa maneira, é possível identificar a absorbância no comprimento de onda máximo de absorção de cada uma dessas soluções, podendo ainda plotar uma curva de calibração que forneça qual a absorbância para cada uma das concentrações. Isso possibilita descobrir, por exemplo, a concentração de uma solução desconhecida a partir da sua absorbância. PRINCÍPIOS DA ABSORÇÃO DE LUZ 1º Princípio Qual a relação da concentração com a interação da luz? 5 Gabriela Rodrigues A absorção da luz é maior nas soluções com maiores concentrações. Então quanto mais concentrada for a solução menos luz irá atravessa-la. Por que isso acontece? Quanto mais concentrada a solução, maior é a quantidade da espécie do analito de interesse, então maior será a absorção. Assim, quanto mais concentração maior será a absorbância daquela solução. 2º Princípio Quanto maior for o caminho óptico maior é absorção da luz, ou seja, quanto maior for a distância percorrida pelo feixe luminoso através da amostra maior é a absorção (mais quantidade de espécie do analito para absorver luz). Existe um modelo matemático que descreva esse comportamento? Lei de Lambert Beer A absorbância de uma espécie em um determinado comprimento de onda é igual ao valor de absortividade molar (A) (quanto uma consegue absorver num determinado comprimento de onda) multiplicado pelo produto da concentração da amostra (c) e a distância percorrida pelo feixe (l). Quando se analisa o que ocorre na cubeta, o que o equipamento analisa de imediato não é a absorbância e sim a transmitância (T), ou seja, o que passou pela cubeta sem ser absorvido. Assim, a transmitância é dada pela radiação que passou pela amostra divida pela radiação incidente. Em termos de porcentagem: Essa transmitância depois é convertida pelo em absorbância. E como é feita essa conversão? E por que não usar a transmitância ao invés da absorbância? Quando se aplica a transmitância graficamente, o comportamento que se tem é: Absorbância ( fixo) 6 Gabriela Rodrigues Trabalhar com a absorbância graficamente é mais fácil. Uma vez que se faz uma linearidade, de modo que é possível trabalhar em termos de uma função de reta (Y = ax + b). APLICAÇÃO Etapas de um processo espectrofotométrico 1ª ETAPA: PREPARAÇÃO - Limpeza do material; - Aferição das vidrarias; - Calibração das balanças; - Preparo de soluções (complexantes, tampões, solução estoque ou solução padrão); - Preparo da amostra (abertura e solução). 2ª ETAPA: QUALITATIVA - Montagem do espectro de absorção. Pela equação de Beer, foi possível verificar que a absorbância é tida em termos de um comprimento de onda. Como saber qual é o comprimento de onda certo? Diversos comprimentos de ondas são incididos na amostra, de forma que a mesma tem uma interação com eles. No entanto, existe um comprimento de onda que a amostra irá absorver mais, e é esse que se quer descobrir. Qual é o comprimento de onda que o analito absorve mais? Para responder tal questão, é preciso se leia uma solução com o analito de interesse e faça a leitura em diversos comprimentos de onda. De modo se vai se ter diversos valores de absorbância. Plota-se o gráfico: O analito em questão tem uma absorção máxima em torno de 610 nm. Qual deve ser a cor dessa amostra? A amostra absorve laranja, a cor complementar é azul-esverdeado, desse modo, a amostra deve ter essa coloração. Assim, 610 nm é o valor de comprimento de onda que vai se usar nas outras etapas. Sendo essa uma característica daquele analito. 3ª ETAPA: - Montagem da curva de calibração e obtenção da equação da reta. A curva de calibração é necessária para saber se o equipamento de fato responde de acordo com a lei de Lambert Beer, uma vez que essa lei tem um comportamento linear, o equipamento também precisa ter. Para isso é necessário o preparo de soluções padrões do analito de interesse, conhecendo assim, a concentração dessas soluções. Faz-se então, uma solução branco (tudo menos o analito). Faz-se soluções de baixa concentração, aumentando-a gradativamente. 7 Gabriela Rodrigues Sabendo o valor de absorção máximo do analito (610 nm). Agora pega-se as as amostras (em ordem crescente de concentração) e faz-se a leitura no equipamento em 610 nm, para saber o quanto esse analito absorve nesse valor. Fazendo as outras leituras, é possível plotar o gráfico (como o da figura). Se o equipamento estiver “ok”, tem-se um comportamento linear, uma vez que quanto maior a concentração, maior a absorbância. Sendo possível então obter a equação da reta. Y = ax + b A equação representada na equação da reta, nada mais é que a equação de Beer, uma vez que l (caminho) é considerado 1. 4ª ETAPA: ANÁLISE - Análise da amostra. Pega-se a amostra e faz-se a aleitura, tem-se um valor de absorbância. O valor obtido é inserido na equação da reta obtida a partir do gráfico da curva de calibração, como sendo Y. Encontra-se X, acha-se a concentração da amostra de interesse. Se houve diluição, é necessário ajustar os cálculos. EM RESUMO: Fatores que afetam a linearidade de Beer 1. Concentrações muito altas do analito em função das diversas interações eletrostáticas entre eles. 2. Dispersão da luz em função da presença de sólidos na amostra. 3. Fluorescência (tempo curto na absorção de luz e emissão de fótons) e fosforescência na amostra. 4. Equilíbrios químicos pouco estabilizados. OBS: É importante observar se há cromóforos (partes da molécula responsáveis pela absorção) na amostra problema. Análise da Cloroquina O intuito aqui é saber se a concentração da amostra problema condiz com o padrão desejado. Para isso, basta fazer o espectro do padrão e da Absorbância Absortividade molar () Concentração “Grau de erro” Sem presença de sólidos Com presença de sólidos Um feixe de luz é passado, sendo possível observar nanopartículas 8 Gabriela Rodrigues amostra e analisar os valores de absorbância obtidos. Parte experimental Pesou-se 0,1 g da amostra de cloroquina e transferiu-se para um balão volumétrico de 100 mL. Adicionou-se 5 mL de água destilada para solubilizar. Em seguida o volume foi completado com ácido clorídrico 0,1% (p/v). Fez-se a diluição em ácido clorídrico 0,1% (p/v) até alcançar uma concentração equivalente a 0,001% (p/v). Para a dilução: M1V1 = M2V2 M1 = 0,1% ; M2 = 0,001% ; V2 = 100 mL V1 = 1 mL O volume necessário da solução amostra para produzir a solução diluída é de 1 mL A solução padrão foi preparada com a mesma concentração, com o mesmo solvente. Para fazer as medições no espectrofotômetro, utilizou-se um comprimento de onda igual a 343 nm (especificado pela Farmacopeia). Utilizando para o branco ácido clorídrico 0,1% (p/v). Primeiro faz-se então a leitura do branco, obtendo a linha de base do espectro. Em seguida, faz-se a leitura da amostra padrão de concentração 0,01 % (p/v). Faz-se a leitura da solução problema com mesma concentração do padrão. Com os resultados realiza-se os cálculos necessários, de acordo com a lei de Beer, para determinação da concentração real, obtendo assim o teor da amostra do difosfato de cloroquina. OBS: lavar a cubeta 3x e enxugar bem. Analisando
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