Quais as condições a serem avaliadas para se obter um meio de cultura adequado?

Meios de cultura são preparações químicas que estimulam o cultivo de microrganismos a serem analisados em um determinado procedimento, permitindo que sejam estudados. Para isso, é indispensável que os meios de cultura possuam nutrientes básicos que alimentes os fungos e bactérias a serem analisados.

© Depositphotos.com / angellodeco Os meios de cultura são preparações químicas que estimulam o cultivo de microrganismos a serem analisados em um determinado procedimento, permitindo que sejam estudados.

Um meio de cultura pode ser sintético, com componentes definidos quimicamente, ou complexo, quando são adicionadas substâncias provenientes da natureza (extrato de carne, peptona, sangue, entre outras). Quanto ao estado físico, pode ser líquido (caldo) ou sólido (caldo com 1,5% a 2% de ágar).

O preparo de um meio de cultura para bactérias requer os seguintes materiais:

• Ágar
• Copos descartáveis
• Frascos de meio de cultura
• Água destilada
• Balança
• Placas de Petri

Caso utilize meios preparados comerciais, pese-os separadamente, usando papel manteiga ou papel alumínio. Após a pesagem do pó, acrescente a água destilada aos poucos, tendo a precaução de homogeneizar cada componente adicionado.

O Brain Heart Infusion (BHI) Ágar é indicado para o cultivo de qualquer micro-organismo em ágar (caldo sólido). Para isso, os materiais necessários são:

• Brain Heart agar (52 g)
• Água destilada (1000 ml)

Dissolva o BHI na água destilada e agite bem. Em seguida, ferva em microondas ou placa aquecida, agitando sempre para dissolver a água. Autoclave em garrafas a meia rosca por 15 minutos a 121º C. Ainda quente, distribua em placas, para evitar que solidifique.

O Brain Heart Infusion (BHI) caldo é indicado para o cultivo de qualquer micro-organismo que requeira um meio líquido. Os materiais necessários são os seguintes:

• Brain Heart broth (37 g)
• Água destilada (1000 ml)

Dissolva o BHI na água destilada e agite bem. Autoclave em garrafas a meia rosca por 15 minutos a 121º C. Distribua o BHI caldo estéril nos tubos.

Atécnica de semeadura varia de acordo com o meio de cultura (caldo ou sólido), mas as seguintes regras devem ser respeitadas em ambos os casos:

• Esterilize por flambagem a agulha e a alça de níquel-cromo antes e após qualquer cultivo. Esfrie-as cuidadosamente antes da coleta.
• Sempre abra os recipientes próximos à chama do bico de Bunsen.
• Evite que as tampas dos tubos e placas fiquem sob a bancada durante o cultivo.
• Não perfure ou rasgue o ágar, pois acarreta o acúmulo de bactérias e altera as condições de crescimento bacteriano.

Para a semeadura em meio sólido: divida a Placa de Petri em três partes, utilizando um pincel marcador para fazer linhas na parte inferior da placa. Depois, mergulhe a alça de platina esterilizada na cultura bacteriana que for usar. Em seguida, faça estrias em cada divisão, respeitando as linhas e utilizando toda a superfície da placa, da melhor maneira possível.

Para a semeadura em meio líquido: Destampe o tubo e retire uma porção de amostra com a alça, fechando-o em seguida. Retire a tampa do tubo que será inoculado e introduza a alça até aproximadamente ¼ de profundidade do meio. Feche o tubo.

Na Microbiologia Clínica há uma vasta opção de meios de cultura disponíveis para as análises microbiológicas, tudo com base na particularidade que cada microrganismo requer para sua fisiologia, nutrição e crescimento.

Hoje quero abordar sobre os meios de cultura e de transporte comumente utilizados na rotina de análises clínicas e suas especificidades.

Dentre os fatores principais que influenciam diretamente no crescimento microbiano está:

• Utilização de O2
• Nutrição
• Temperatura

Na microbiologia de rotina em análises clínicas as análises microbiológicas são processadas em amostras de urina, fezes, sangue, secreções, fluídos, líquidos biológicos, raspados e fragmentos de tecido. Algumas vezes podemos receber amostras para isolamento e identificação de patógenos em dispositivos médicos e materiais cirúrgicos, como cateteres por exemplo.

Esse padrão de amostras, somado a outros fatores importantes, irá refletir na escolha dos meios de cultura que serão utilizados como padrão por cada laboratório de análises clínicas no processamento das amostras biológicas.

Algumas amostras, assim que são colhidas, precisam ser acondicionadas em frascos ou swabs contendo meio de transporte para preservação, estabilização e conservação do microrganismo até sua chegada ao laboratório.

Meios de Transporte

Meio Stuart ou Amies

O swab contendo o meio de Stuart, ou Amies, é utilizado nas coletas de secreções, como por exemplo em feridas (cirúrgicas ou não), em que é necessário o isolamento de bactérias aeróbias ou aeróbias facultativas.

Meio de Cary-Blair

É um meio utilizado tanto na forma líquida em frascos de transporte, como também na forma de gel em swabs.

O meio de Car-Blair é um conservante para amostra de fezes onde é necessário isolar, conservar e preservar os enteropatógenos.

Lembrando que, assim como o Meio de Stuart, o Meio de Cary-Blair é um meio de transporte.

Falando sobre o transporte de amostras, é importante salientar alguns pontos importantes:

1. Os meios de transporte preservam a viabilidade dos microrganismos e evitam a proliferação bacteriana que podem interferir na posterior análise das amostras.
2. A coleta e o transporte inadequado dessas amostras podem também interferir e prejudicar o isolamento do patógeno de interesse.
3. Quando se opta por um determinado método de coleta, precisa-se pensar na forma na preservação tanto da amostra como do microrganismo presente até a chegada ao laboratório e sua posterior análise.
4. Obviamente o material deve ser coletado no local correto da infecção e com técnica de assepsia adequada.
5. Um ponto extremamente importante, é preciso definir o momento ideal ou mais adequado para coleta e pesquisa de um patógeno em específico para que se aumente as chances de recuperá-lo ao processar a cultura.
6. Sempre que possível, deve-se proceder com a coleta antes da ministração de antibióticos (salvo em condições específicas de acordo com a situação clínica do paciente e sob orientação/solicitação do médico responsável)

Meios de Cultura

Ágar Sangue Sangue de Carneiro (5%) - Ágar Sangue

Meio de cultura não seletivo (rico) que possibilita o crescimentode bactérias Gram-negativas, bactérias Gram-positivas e leveduras. O ágar sangue permite também a formação de halos de hemólise produzidos por determinados microrganismos como Streptococcus spp e Staphylococcus spp.

É utilizado, em geral, nas seguintes rotinas:

1. Isolamento de microrganismos não fastidiosos
2. Na prova de satelitismo para identificação presuntiva de Haemophilus spp
3. Se há formação de hemólise produzida pelos Streptococcus spp e Staphylococcus spp

Com relação à hemólise formada no meio de cultura, são classificadas em:

• Alfa hemólise: presença típica de alo esverdeado ao redor das colônias semeadas (refere-se à lise parcial dos eritrócitos).
• Beta hemólise: quando há presença de halo transparente ao redor das colônias (característica da lise total dos eritrócitos)
• Gama hemólise: ausência de halo ao redor das colônias, isto é, quando NÃO ocorre lise dos eritrócitos no meio de cultura (eritrócitos íntegros).

Hemólises produzidas no Ágar Sangue.

Ágar Chocolate

Um dos meus meios de cultura prediletos!

É um meio nutritivo, utilizado para crescimento e isolamento de microrganismos exigentes, embora permita o crescimento de praticamente todos os tipos de microrganismos. Em sua produção é adicionado sangue de cavalo, carneiro ou de coelho em temperatura alta fazendo com que as hemácias lisem e favorecendo a liberação de hemina e hematina, quesão essenciais para o crescimento dos microrganismos exigentes.

Dentre os patógenos que maneira geral são identificados pelo crescimento em ágar chocolate estão a Neisseria spp, Haemophilus spp, Branhamella catarrhalis e Moraxella spp.

Figura mostrando clônias de Haemophilus influenzae em ágar chocolate.

Colônias de Neisseria gonorrheae em ágar chocolate.

Ágar Thayer-Martin

É um meio de cultura muito semelhante ao Ágar Chocolate, porém é utilizado especificamente para o isolamento seletivode N. gonorrheae e N. meningitidis.

Contém em sua formulação antibióticos que inibirão o crescimento de Neisserias saprófitas, e também de outras bactérias, quando em amostras colhidas de sítios contaminados.

Ágar Eosin Methilene Blue – EMB

E.coli em Meio Ágar EMB. Fonte da Imagem: Natália Menezes, acervo pessoal.

Trata-se de um meio de cultura seletivo e diferencial utilizado em culturas para crescimento e pesquisa de Bacilos Gram-negativos.

É um meio chamado de seletivo e diferencial porque permite o crescimento somente de bactérias Gram-negativas e diferencia os Bacilos Gram-negativos fermentadores de lactose em lactose-positiva e lactose-negativa.

Ágar MacConkey

Meio de cultura diferencial e seletivo que permite o crescimento de Bacilos Gram-negativos, diferenciado-os em lactose-positiva e lactose-negativa. Ele irá isolar os Bacilos Gram-negativos (enterobactérias e não-fermentadores) e verificar a fermentação ou não da lactose.

A classificação em lactose-positiva e lactose-negativa refere-se a cor que as colônias adquirem ao fermentar ou não a lactose presente no meio:

• Lactose-positiva: colônias na cor rosa (fermentadoras da lactose)
• Lactose-negativa: colônias incolores (não-fermentadoras da lactose)

Meio Ágar MacConkey mostrando colônias fermentadoras (lado esquerdo) e não-fermentadoras da lactose (lado direito).

A função de seletividade do Ágar MacConkey se dá por causa do cristal violeta presente na sua formulação que atuará como inibidor do crescimento de microrganismos Gram-positivos, especialmente os enterococos e estafilococos. A concentração de sais de bile é relativamente baixa neste meio de cultura, sendo assim o Ágar MacConckey não é tão seletivo para Gram-negativos como, por exemplo, o Meio Ágar Salmonella-Shigella (Ágar SS).

Ágar Salmonella-Shigella (Ágar SS)

É um meio de cultura seletivo e diferencial utilizado para o crescimento e isolamento de Salmonella spp e Shigella spp.

Sua composição contém sais de bile, verde brilhante e citrato de sódio que inibirão o crescimento de microrganismos Gram-positivos. Também possui lactose na sua formulação, o que permitirá ver se o microrganismo é lactose-positiva (bactérias que fermentam a lactose e produzem um ácido que na presença de indicador vermelho neutro resultam no crescimento de colônias de cor rosa) ou lactose-negativa produzindo colônias incolores.

O Ágar SS também possui como ingredientes o tiossulfato de sódio e o citrato férrico, estes compostos permitirão a detecção do H²Sevidenciado pela formação de colônias de cor negras ao centro, típicas da Salmonella entérica.

 Ágar CLED (Cystine Lactose Electrolyte Deficient)

Meio de cultura utilizado no isolamento e identificação dos patógenos causadores das infecções urinárias.

É usado para o isolamento e quantificação de microrganismos presentes em amostras de urina, permitindo o crescimento de microrganismos Gram-negativos, Gram-positivos e leveduras.

A utilização mais comum deste meio de cultura é no kit de laminocultivo chamado Uribac, da PROBAC.

Kit de laminocultivo Uribac, da PROBAC.

Este kit de laminocultivo é utilizado para isolamento de patógenos causadores das infecções de urina permitindo uma rápida identificação da Escherichia coli e, também, verificar se houve a transformação do triptofano em ácido indolpirúvico pela Morganella spp, Proteus spp e Prodidência spp.

Este kit contém em sua composição: Ágar CLED, citrato de Simmons e Meio I (Ágar MacConkey modoficado).

Geralmente este kit também acompanha o Reativo de Kovacs, utilizado para determinar a capacidade do microrganismo em produzir indol a partir do triptofano.

O indol é um dos produtos de degradação imediata da desaminação do triptofano presente no meio de cultura, e ao pingar este reagente no meio poderá facilmente ser observado a formação de um complexo vermelho.

Ágar Mueller-Hinton

É um meio de cultura padronizado por Kirby & Bauer e pelo CLSI, e oferece condições de crescimento para as principais bactérias.

É normalmente utilizado na realização dos testes de resistência aos antimicrobianos (antibiograma) pelo método de difusão em disco de E-test para enterobactérias, não-fermentadores, Staphylococcuse Enterococcus sp.

A zona do raio formado ao redor de cada disco é muito particular de cada antibiótico e também de cada microrganismo. Durante a análise do antibiograma, esse halo formado será comparado com vários diâmetros padronizados pelo CLSI que determinará cada microrganismo como sendo sensível, intermediário ou resistente. 

Existem outros meios de cultura usados na rotina de análises clínicas, como por exemplo:

Ágar Lowenstein-Jensen: utilizado para isolamento primário das micobactérias.

Ágar Hektoen Enteric (Ágar HE): utilizado para isolar e diferenciar os membros da espécie Salmonella e Shigella de outros Enterobacteriaceae.

O Ágar Lowenstein-Jensen e o Ágar Hektoen Enteric (Ágar HE) são meios de cultura utilizados em situações bastante raras, isso porque o número de casos clínicos nos quais o médico solicita esse tipo específico de cultura é bem baixo e a possibilidade de se trabalhar com esses meios de cultura na bancada será difícil.

Portanto, preferi me conter aos meios de cultura com maiores chances de se trabalhar na rotina de microbiologia clínica, tanto em Hospitais como em Laboratórios particulares, e com isso facilitar o aprendizado de quem ainda não tinha esse conhecimento técnico.

Em um artigo futuro falarei sobre a interpretação do crescimento dos microrganismos na cultura primária e também das provas bioquímicas de identificação usadas na rotina laboratorial.

Fiquem ligados e até o próximo conteúdo!!

Por: Bruno Brunetti

LinkedIn: https://www.linkedin.com/in/brunobrunetti/

Referências para este artigo

Adryella de Paula Ferreira Luz, Microbiologia aplicada em Análises Clínicas, Centro Universitário São Camilo

http://www.imgrum.org/media/1027424488869792238_1986611985

http://www.anvisa.gov.br/servicosaude/controle/rede_rm/cursos/boas_praticas/MODULO2/isolamento.htm

https://pt.wikipedia.org/wiki/%C3%81gar_Thayer-Martin_chocolate#/media/File:Neisseria_

http://bioneogenios.blogspot.com/2013/07/meios-de-cultura-bacteriologicos.html

https://1.bp.blogspot.com/-EJ7Fpn8C-WM/VhZoS_wIRNI/AAAAAAAAD7A/egUzLMTTV6g/s1600/McC.jpg

https://pt.wikipedia.org/wiki/%C3%81gar_MacConkey#/media/Ficheiro:MacConkey_agar_with_LF_and_LF_colonies.jpg

https://www.lojamasterdiagnostica.com.br/uribac-laminocultivo-50un-pr-4-346769.htm

http://www.probac.com.br/Anexos/Bulas/Reativos/Reagente%20de%20KOVACS-02.pdf

https://maestrovirtuale.com/agar-mueller-hinton-fundacao-preparacao-e-usos/

Quais as condições para um meio de cultura adequado?

Como deve ser feita a escolha de um meio de cultura?

Quais são as principais condições que devem ser consideradas no cultivo de microrganismos?

Quais são as condições ideais para se cultivar microrganismos no laboratório de microbiologia?