Qual o tipo de microscópio mais indicado na rotina microbiológica?

Desde o 1º período da faculdade de Medicina, você se depara com o laboratório de microscopia. Isso ocorre na disciplina de histologia, em que todos os tecidos do nosso organismo podem ser observados no microscópio, sendo possível observar as células e como o tecido é estruturado, ou na disciplina de microbiologia, na qual estudamos diversos microrganismos e os observamos como bactérias, por exemplo.

Mais à frente, você entra na patologia e observa essas imagens histológicas microscópicas novamente, com alterações patológicas, apesar de a coloração ser feita da mesma forma.

No entanto, para que tudo isso seja possível, as lâminas para observação precisam ser preparadas, passando por várias etapas. Uma dessas etapas é a coloração, ou seja, esses tecidos e microrganismos são corados para que consigamos vê-los na microscopia óptica.

As colorações nem sempre são as mesmas, pois temos colorações que facilitam a observação de determinado tecido ou determinado microrganismo.

Hematoxilina-eosina, H&E ou HE

Uma dessas colorações, muito conhecida por sinal, é a coloração de hematoxilina-eosina (HE), você já deve ter ouvido falar. Essa coloração é muito utilizada na histologia para corar diversos tecidos do nosso organismo. Provavelmente foi a primeira coloração que você viu. “Mas como é realizada, e por que recebe tal nome?”. Isso é de grande importância para entender o que significa cada cor presente na lâmina.

A hematoxilina é um corante básico, que tem atração a substâncias ácidas (lembre que os opostos se atraem). Essas substâncias ácidas, portanto, são coradas pela hematoxilina, e recebem o nome de basófilas (que fixam corantes básicos, pois “gostam” de básicos).

Mas nem tudo é ácido nas células e tecidos. A eosina, ao contrário da hematoxilina, tem caráter ácido e, sendo assim, atrai substâncias básicas, conhecidas como acidófilas (que fixam corantes ácidos).

“Já entendi quem cora as substâncias ácidas e as básicas, mas e aí? Como eu vou saber isso apenas olhando uma lâmina?”. É simples: a hematoxilina é um corante de cor azul-púrpura, ou seja, o que você observar na lâmina com essa cor é uma substância de caráter ácido, portanto, basófila, pois foi atraída pela hematoxilina.

A eosina é um corante vermelho. Dessa forma, tudo aquilo que você observar na lâmina com essa cor é uma substância básica, e que foi atraída pela eosina (que é ácida), sendo, então, uma substância acidófila.

Resumindo:

Exemplificando:

Quando observamos uma célula por microscopia, seu núcleo se apresenta na coloração azul-púrpura, ou seja, é basófilo. Isso porque o núcleo de uma célula é rico em DNA (ácido desoxirribonucleico), ou seja, é atraído pele hematoxilina (um corante básico).

Já o citoplasma da célula tem um caráter mais básico e é, portanto, corado em tonalidades de vermelho pela eosina. Algumas regiões do citoplasma podem se apresentar azuladas, pois, há RNA (ácido ribonucleico) nelas, que é corado pela hematoxilina.

Essa coloração é a mais utilizada em histologia e patologia, mas não é a única, pois nem todas as estruturas podem ser observadas pela HE.

Coloração em prata

Alguns tecidos não são corados pela hematoxilina–eosina, como é o caso de fibras reticulares.

As fibras reticulares são formadas por colágeno do tipo III, e ricas em glicoproteínas e proteoglicanos, que formam as redes. Estão presentes em órgãos como fígado, medula óssea, baço, linfonodos, e formam um arcabouço, uma rede de sustentação. E é assim que elas são vistas no microscópio.

Para observar essas fibras em microscopia óptica, algumas técnicas específicas podem ser utilizadas, como a coloração ou impregnação em prata.

Essas fibras têm a peculiaridade da argirofilia. Argirofilia é uma palavra que deriva do grego, e quer dizer àrgyros (= prata) e philia (= amor, amigo), ou seja, substâncias que são identificadas pela prata por terem afinidade por esta.

Ao observar a lâmina impregnada pela prata, essas fibras apresentam-se enegrecidas.

Tricrômico de Masson

Como o nome “tricrômio” sugere, utilizam-se três cores, que vão diferenciar diferentes estruturas. Mas o principal destaque dessa técnica são as fibras de colágeno do tipo I, facilitando a sua observação. Nessa técnica, as fibras colágenas assumem a coloração verde. Além disso, permitem observar o núcleo e o citoplasma das células muito bem.

Coloração Gram

Na microbiologia, você já deve ter ouvido sobre a coloração de GRAM, utilizada para corar lâminas com determinadas bactérias. Essa é uma técnica antiga e amplamente utilizada até os dias atuais.

Se justifica pela composição da parede bacteriana. É isso mesmo! A composição da parede das bactérias define a coloração em Gram, e são separadas então em dois grandes grupos bacterianos: GRAM+ (positivas) e GRAM- (negativas).

“Mas por que fazer uma coloração se elas já são diferentes pela parede?”. Apesar de a parede ter diferenças importantes na composição e na espessura, não conseguimos observar esses detalhes na microscopia óptica. Por isso que Gram desenvolveu a técnica que cora esses dois grupos bacterianos, de colorações diferentes, de acordo com sua parede – assim, podemos diferenciá-las pela cor apresentada na lâmina.

Uma bactéria conhecida como GRAM+ é uma bactéria que tem várias camadas de peptideoglicano, formando uma parede espessa, mas não possui membrana externa.

Já as bactérias conhecidas por serem GRAM– têm uma fina camada de peptideoglicano, mas possuem membrana externa (composta principalmente por LPs – Lipopolissacarídeos).

Até agora, falei da composição da parede, mas como já disse, isso não é visto pelo microscópio óptico. Vamos falar então, daquilo que dá pra ver, que é a cor.

Como é feita a coloração Gram

1. Primeiro, coloca-se o material a ser avaliado na lâmina;
2. Cristal Violeta (violeta de genciana): aplica-se o cristal, que leva a uma coloração bem roxa;
3. Lava-se com água;
4. Lugol (um mordente para fixar o corante violeta);
5. Lava-se com água;
6. Descolore-se com álcool;
7. Fucsina (corante avermelhado);
8. Lava-se a lâmina com água;
9. Seca-se a lâmina, e então se observa no microscópio.

Agora vamos entender o que acontece nessas etapas.

As bactérias GRAM positivas são bactérias com parede espessa. Ao colocar o corante violeta, a sua parede absorve muito desse corante, assumindo a coloração roxa. Quando chega na etapa de descoloração com álcool, elas não são totalmente descoloradas, pois sua parede tem várias camadas e a violeta de genciana se fixou fortemente ali. A fucsina também não é absorvida por conta desse corante violeta. Por isso, as bactérias GRAM positivas possuem coloração roxa.

Exemplos de Gêneros de Bactérias GRAM positivas: Staphylococcus, Enterococcus, Streptococcus

As bactérias GRAM negativas, por sua vez, são bactérias com parede delgada. Quando se adiciona a violeta, elas se coram, porém, ao lavá-las, essa violeta começa a ser removida. E, na descoloração com álcool, a remoção do corante violeta se conclui, pois a parede é muito fina e quase não absorveu o corante. Com isso, essas bactérias tornam-se novamente descoloradas, o que impossibilitaria visualizá-las no microscópio. Então, adiciona-se a fucsina, que é absorvida, e as bactérias passam a apresentar a coloração avermelhada.

Exemplos de Bactérias GRAM negativas: Escherichia coli, Helicobacter pylori, Salmonella, Shigella.

Você consegue identificar a qual grupo essa bactéria pertence de acordo com a coloração:

Mas nem todas as bactérias são bem coradas pelo método de GRAM, e portanto, existem outros métodos, como veremos a seguir.

Outros tipos de coloração

Coloração de Ziehl-Neelsen (ZN)

Algumas bactérias não são bem coradas pelo método de GRAM, e portanto outros métodos são utilizados, como a técnica de Ziehl-Neelsen. Algumas importantes bactérias são coradas por essa técnica, como as do gênero Mycobacterium, da tuberculose e da lepra, por exemplo.

Essas bactérias são álcool-ácido resistentes (BAAR) e, sendo assim, resistentes à etapa de descoloração do método de GRAM. Essa característica se deve também à composição da parede dessas micobactérias, que possuem ácidos micólicos (lipídeos).

A técnica é realizada da seguinte maneira:

1. Aplicação do material a ser analisado, por exemplo, uma amostra de escarro;
2. Adição de fucsina na lâmina;
3. Aquecimento da lâmina até a emissão de vapores (não deixando ferver);
4. Espera de cerca de 7 minutos;
5. Lavagem com água;
6. Cobertura da lâmina com álcool-ácido até descorar o esfregaço;
7. Lavagem com água;
8. Cobertura da lâmina com azul de metileno;
9. Lavagem com água;
10. Secagem e observação ao microscópio.

E qual o sentido de tudo isso? É simples. Ao aquecer a lâmina contendo a fucsina, os lipídeos são derretidos pela ação do calor. Com isso, a fucsina penetra em todas as bactérias. Ao descorar com álcool-ácido, todas as bactérias são descoradas, exceto as bactérias álcool-ácido resistentes. Ou seja, essas bactérias estarão na cor vermelha, pois foram coradas com a fucsina. Já as demais bactérias, que foram decoradas, estarão sem coloração nenhuma. Então, quando se adiciona o azul de metileno, elas assumem tal coloração.

Resumindo:

Coloração de Giemsa

Outra coloração muito utilizada, e que não eu não poderia deixar de falar, é a coloração de Giemsa. Ela é muito utilizada para corar lâminas de sangue periférico ou da medula óssea.

Por meio dessa coloração, podemos observar as células sanguíneas (plaquetas, eritrócitos e leucócitos). Também é utilizada para visualizar protozoários do gênero Plasmodium (o causador da malária).

Quando observamos uma lâmina de sangue periférico corada por Giemsa, temos as células sanguíneas em diferentes aspectos e colorações, podendo, então, diferenciá-las.

As plaquetas apresentam-se numa coloração próxima do azul.

Já as hemácias/eritrócitos são visualizados na cor rósea (com palidez central – o centro se apresenta mais claro).

Os leucócitos, que são muitos, podem ser diferenciados em microscopia óptica quando corados por Giemsa.

Os linfócitos apresentam o citoplasma azul e o núcleo azul-violeta (mais escuro).

Já os monócitos possuem uma peculiaridade em seu núcleo, que é o aspecto lobulado, e este apresenta-se na coloração azul violeta, enquanto o citoplasma é azul claro.

Os granulócitos, como o próprio nome diz, contém grânulos, que são vistos no citoplasma. Os granulócitos são neutrófilos, basófilos e eosinófilos. Os neutrófilos são polimorfonucleares, tendo entre 2 e 4 lóbulos, e seu núcleo é corado em azul. Seu citoplasma apresenta cor rosa pálido, e também contém grânulos, que são vistos numa coloração de tons róseos a azul claro.

Já os basófilos possuem o núcleo azul escuro, mas sua grande peculiaridade são seus grânulos, que são volumosos, corados também em azul escuro, ocupando todo o citoplasma, e podendo se sobrepor ao núcleo.

Os eosinófilos possuem o núcleo azul, citoplasma rosa pálido, e seus grânulos são vermelhos, ao contrário dos outros granulócitos.

Além de corar as células sanguíneas, permitindo-nos observar todas essas características morfológicas, a técnica de Giemsa também cora alguns parasitas, como é o caso do Plasmodium (causador da Malária) e do Trypanosoma cruzi (agente causador da doença de Chagas).

Todas essas técnicas são muito utilizadas para o estudo de diversas estruturas, sejam estas os tecidos que compõe o organismo ou microrganismos. Mas elas não são as únicas colorações. Há uma infinidade de colorações diferentes, e específicas com que você pode se deparar ao longo do caminho, dependendo de qual seja a área estudada.

Tenho certeza que essas colorações abordadas hoje são muito recorrentes e importantes. Sendo assim, é bom que você saiba identificá-las e entendê-las, pois, dessa forma, certamente seu estudo se tornará mais fácil e mais eficaz.

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